一、基因工程成功的关键？

一、什么是基因工程工具酶,有什么用?

基因工程的关键技术是DNA的连接重组。科学家根据分子遗传学的发现,应用生物化学提取和鉴定酶的技术,找到了一系列基因工程的工具酶。基因工程使用的工具酶具有一个重要特征：每一种酶都具有自身特定的功能。有的像"手术刀",可以进行DNA分子的特定切割；有的像"粘合剂",可以促进DNA分子之间的粘合和连接；有的像"砌砖机",可以合成完整的双链DNA分子．基因工程常用的工具酶可分为：限制性内切酶、DNA连接酶、DNA片段末端修饰酶等。

限制性核酸内切酶,简称限制酶。它的发现和应用为从细胞基因组中分离目的基因提供了重要工具。限制酶能够识别DNA大分子链上特定的核苷酸顺序,并能在某一特定部位将DNA断裂。这样,目的基因便有可能完整地存在于某一DNA片段上,然后再把它们分离出来。在基因工程中,限制酶是一种必不可少的工具酶,是进行DNA分子切割的特殊工具．因此它有"分子剪刀"或"分子手术刀"之称。

目前已经发现的限制酶多达20多种．每一种都有极强的特异性,可以准确无误地进行核苷酸的识别,决不会错切一刀。一般情况下,一种限制性内切酶能识别4－6个核苷酸序列。

为了便于DNA片段的连接往往用不同的酶对DNA片段末端进行修饰这种酶就是DNA片段末端修饰酶。

不同的DNA片段之间的连接需要另一种工具酶----连接酶的帮助．这种酶也是在细菌中发现的．如果说内切酶是对基因操作的"剪刀",那么连接酶就是"浆糊"。

二、什么是基因克隆载体?

目的基因在经过体外改造后,必须进人受体细胞内才能进行扩增和生物表达。但是用于DNA重组体的目的基因,不能直接引人受体细胞，因为每种生物都是长期进化的产物,具有很强的排他性．外源DNA如果单独进人受体细胞,必将被破坏。因此,必须有一种运载基因的载体作媒介物,才能达到目的．载体在基因工程中的作用,就像过河时必须有船一样．载体运载外源DNA进入受体细胞,是通过在载体自身的DNA核酸序列中插人外源DNA,再进人受体细胞内进行复制,在载体DNA复制时,外源DNA分子也获得了扩增和表达。

目前经常使用的载体,有质粒和病毒两类．各种不同的载体,尽管分子量大小、结构和用途上存在着较大的差异,但是作为载体,它们应该具备一些共同的特性：

1.能在受体细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制．在其DNA插入外源基因后,仍然保持稳定的复

二、生物，转录是怎么形成trna的，过程是什么啊？

与我们熟悉的mRNA转录过程（使用RNA聚合酶II）不同，tRNA和其他不翻译成蛋白质的RNA一样，是使用RNA聚合酶III转录的。

具体来说，编码tRNA的DNA区域有特殊的能被RNA聚合酶III识别的启动子和终止子，能特异性招募RNA聚合酶III来转录tRNA。

三、真核生物基因的转录过程和调控方式有哪些？

1、转录起始水平。

这一环节是调控的最主要环节，由对基因转录活性的调控来完成，包括基因的空间结构、折叠状态、DNA上的调控序列、与调控因子的相互作用等。a.活化染色质：在真核生物体内，RNApol与启动子的结合受染色质结构的限制，需通过染色质重塑来活化转录。常态下，组蛋白可使DNA链形成核小体结构而抑制其转录，转录因子若与转录区结合则基因具有转录活性。因而基础水平的转录是限制性的，核小体的解散时必要前提，组蛋白与转录因子之间的竞争结果可以决定是否转录。组蛋白的抑制能力可因其乙酰化而降低。另外，由于端粒位置效应或中心粒的缘故，抑或是收到一些蛋白的调控，真核生物细胞可能出现10%的异染色质，异染色质空间上压缩紧密，不利于转录。b.活化基因：真核生物编码蛋白的基因含启动子元件和增强子元件（启动子：在DNA分子中，RNA聚合酶能够识别、结合并导致转录起始的序列。增强子：指能使与它连锁的基因转录频率明显增加的DNA序列。），转录因子与启动子元件相互作用调节基因表达；转录激活因子与增强子元件相互作用，再通过与结合在启动子元件上的转录因子相互作用来激活转录。两种元件以相同的机制作用于转录。真核生物RNApol对启动子亲和力很小或没有，转录起始依赖于多个转变路激活因子的作用，而若干个调节蛋白与特定DNA序列的结合大大提高了活化的精确度，无疑是这一作用机制的一大优势。在这一作用中，增强子与适当的调节蛋白作用以增加临近启动子的转录是没有方向性的，典型的增强子可以出现在转录起始位点上游或下游。RNApol与启动子的结合一般需要三种蛋白质的作用，即基础转录因子（又名通用转录因子）、转录激活因子和辅激活因子。能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件上，参与调控靶基因转录的蛋白质又名转录因子。基础转录因子与RNApol结合成全酶复合物并结合到启动子上，转录激活因子可以以二聚体或多聚体的形式结合到DNA靶位点上，远距离或近距离作用域启动子。在远距离作用时，往往还会有绝缘子参与，以阻断邻近的增强子对非想关基因的激活；在近距离作用时，结构转录因子可以改变DNA调控区的形状，使其他蛋白质相互作用、激活转录。2、转录后水平。真核生物mRNA前体须经过5’-加帽、3’-加尾以及拼接过程、内部碱基修饰才能成为成熟度的mRNA，加帽位点与加尾位点、拼接点的选择就成了调控的手段。a.5’-加帽：几乎所有的真核生物和病毒mRNA的5’端都具有帽子结构，其作用为保护mRNA免遭5’外切酶降解、为mRNA的核输出提供转运信号和提高翻译模板的稳定性和翻译效率。实验证实，对于通过滑动搜索起始的转录过程来说，mRNA的翻译活性依赖于5’端的帽子结构。b.3’-加尾：3’UTR序列及结构调节mRNA稳定性和寿命

四、DNA的限制性酶切及电泳分析实验方法？

1. 反应体系的建立：⑴ 在一无菌1.5 ml Eppendorf管中加入：?无菌双蒸水 7 μl?10×酶切缓冲液 2 μl?质粒DNA(100 ng/μl) 10 μl?EcoRⅠ(5 U/μl) 1 μl?总体积为20μl⑵ 轻轻混匀，12000 rpm离心5 sec。

2. 37 ℃水浴1 h。3. 将Eppendorf管置65 ℃水浴中10 min，通过加热使酶失活以终止反应。4. 12000 rpm离心5 sec，将管盖及管壁上的水离下。5. 取10 μl消化产物，与2 μl 6×上样缓冲液混匀，琼脂糖凝胶电泳检测消化效果，电泳条件：约100 V 30～60 min。6 结果观察。操作注意事项：1. 吸样量一定要准确2. 为了不使酶污染而导致浪费，最后才加酶3. 要求在冰上操作，并充分混匀，4. 开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以防污染。5. 样品在37 ℃与65 ℃保温时，将离心管盖严，以防水进入管内造成实验失败。限制性内切酶酶解中常见的问题和原因1. DNA完全没有被限制性内切酶切割：①限制性内切酶失活;②DNA不纯，含有SDS、有机溶剂、EDTA等;③非限制性内切酶最佳反应条件;④酶切位点被修饰;⑤DNA上不存在该酶的识别顺序。2. DNA切割不完全：①限制性内切酶活性下降或稀释不正确;②DNA不纯或反应条件不佳;③酶切位点被修饰;④部分DNA溶液粘在管壁上;⑤酶切后DNA粘末端退火。3. DNA片段数目多于理论值：①限制性内切酶星号活力;②存在第二种限制性内切酶污染;③样品DNA中含有其它DNA。可以到生物帮上查找这方面的信息啊，那里拥有生物领域内丰富的资源，有空的话，可以去 www.bio1000.com/zt/dna/164670.html 那里看下啊。

五、为什么基因是体现生物遗传效应的结果单位和功能单位？

因为基因控制蛋白质的合成。蛋白质是生命活动的体现者。基因改变->蛋白质结构改变->蛋白质的功能改变->性状改变。所以基因是体现生物遗传效应的结果单位和功能单位。

由于组成每种蛋白质分子的氨基酸种类不同，数目成百上千，排列次序变化多样，由氨基酸形成的肽链的空间结构千差万别。因此，蛋白质分子的结构具有多样性，这就决定了蛋白质分子功能的多样性。（结构决定功能）蛋白质的功能有：1．结构蛋白：是构成细胞和生物体结构的重要物质。（肌肉蛋白、血红蛋白、染色体蛋白、核糖体蛋白、膜蛋白等）2．功能蛋白：（1）催化功能。（大多数酶）（2）调节功能。（胰岛素、生长激素、促激素等）（3）运输作用。（血红蛋白、主动运输的载体）（4）免疫作用。（抗体）（5）识别和信息传递作用。（细胞膜上的糖蛋白）

六、原核生物基因表达的主要模式和特点？

原核生物的基因包括编码区和非编码区,它的编码区是连续的,没有内含子和外显子,所以转录形成的RNA不用加工,长度和编码区相等.

1、基因表达包括转录和翻译。2、真核生物的转录在细胞核内完成，再到细胞质中翻译，原核生物由于没有细胞核，所以它的转录和翻译同时在细胞质中进行。

原核生物基因的表达调控最重要的特点是操纵子模式，从调控水平来看主要在转录水平，即对RNA合成的调控，翻译水平次之。通常有两种方式:

①起始调控，即启动子调控；

②终止调控，即衰减子调控。原核基因组的调控机制：通过负调控和正调控因子所进行的复合调控，阻遏蛋白与操纵基因结合，妨碍RNApol与P结合形成开放性启动子复合物，阻止基因转录；当阻遏蛋白与操纵子基因解离时，RNA聚合酶与启动子结合，起始基因转录，

①转录起始调控：σ因子控制特定基因的表达，不同σ因子可以竞争结合RNA聚合酶，RNA聚合酶的核心酶与不同σ因子组成的全酶识别不同基因的启动子。乳糖操纵子是原核生物基因转录调控的最典型模式，乳糖操纵子的转录调控机制：通过正负调控因子所进行的复合调控。阻遏蛋白与操纵子基因结合，妨碍RNApol与P结合形成开放性启动子复合物，阻止基因转录；CAP与CAP结合位点结合促进RNApol与P结合，引起有效转录。乳糖操纵子结构基因转录需要具备两个条件：a、阻遏蛋白与操纵基因解离b、CAP与CAP结合位点结合。（阿拉伯糖操纵子转录调控、色氨酸操纵子转录调控）

②转录终止的调控：原核生物的转录终止调节方式分两大类：依赖ρ因子和不依赖ρ因子的终止调控；

③翻译水平的调控：SD序列的顺序及位置对翻译的影响，SD序列是位于mRNA起始密码子AUG上游的3-9个碱基组成的一段核苷酸序列，它是核糖体结合位点。

七、植物基因改造过程？

植物基因改造是指通过人工手段将外源基因导入植物细胞中，使其表达出新的性状或功能。

其过程主要包括以下几个步骤：

1. 选择目标基因：

根据需要改造的性状或功能，选择合适的外源基因作为目标基因。

2. 克隆目标基因：

通过PCR扩增或基因库筛选等方法，将目标基因克隆到载体中。

3. 构建转化载体：

将目标基因载体与植物表达载体进行重组，构建成适合植物转化的转化载体。

4. 转化植物细胞：

将转化载体导入植物细胞中，使其表达出目标基因。

5. 筛选转化植株：

通过筛选转化植株，筛选出表达目标基因的植株。

6. 鉴定转化植株：

通过PCR、Southern blot等方法，鉴定转化植株是否成功表达目标基因。

7. 选育优良品种：

通过杂交、自交等方法，选育出表达目标基因的优良品种。

以上是植物基因改造的主要步骤。

其原因在于，植物基因改造需要通过人工手段将外源基因导入植物细胞中，使其表达出新的性状或功能。

因此，需要选择合适的目标基因，构建适合植物转化的转化载体，将转化载体导入植物细胞中，筛选出表达目标基因的植株，并通过鉴定和选育等方法，最终得到表达目标基因的优良品种。

八、DNA的原料和过程？

DNA复制的原料和过程？

DNA复制原料：4种脱氧核苷酸；转录原料：4种脱氧核苷酸；翻译原料：20种氨基酸。

1、DNA复制是指DNA双链在细胞分裂以前的分裂间期S期进行的复制过程，复制的结果是一条双链变成两条一样的双链，每条双链都与原来的双链一样。这个过程通过边解旋边复制和半保留复制机制得以顺利完成。

2、转录

(1)概念：在细胞核中，以DNA的一条链为模板，按照碱基互补配对原则，合成RNA的过程。

(2)过程：DNA解旋（需要解旋酶）→游离脱氧核糖核苷酸与DNA一条链上碱基互补配对→RNA新链的延伸→合成的RNA从DNA链上释放，DNA双链

转录形成的RNA有三种，mRNA、tRNA、rRNA。

mRNA:携带遗传信息，蛋白质合成的模板

tRNA:转运氨基酸，识别密码子

rRNA：核糖体的组成成分